Сардэчна запрашаем перевод: Error 404 (Not Found)!!1

Это были одни из лучших времен года.

У нас было лучших раза с этими тако, Шон.

Подумайте … если кто-то скажет вам, что ваши лучшие времена прошли.

Спасибо за лучших времен когда-либо.

Панис опустился на четвертое место, опередив Герхарда Бергера, их лучших результата разницей в одну десятую секунды.

Некоторые из наших лучших времен вместе всегда были связаны с большой трапезой.

Первая проба состоит из десяти кругов … и четырех лучших времен остаются.

лучших времен для вашего возраста.

Этот инструмент дает вам полную разбивку из лучших времен для твита.

«Путешествие было для меня лучших времен с внуками», — заключает она.

Весна (январь-июнь) — лучшие времена для таких севооборотов.

Воспользуйтесь одним из лучших времен дня для наблюдения за дикой природой.

Раннее утро и вечер — лучшее время для наблюдения за дикой природой.

лучшие времена , чтобы увидеть настоящую Сардану, приходятся на фестиваль.

лучшее время для кратома может варьироваться в зависимости от некоторых индивидуальных параметров.

Сумма лучших результатов по каждой команды определит результат.

В лучших временах провинции было 5 Братьев.

Дневная рыбалка на окуня иногда может быть лучшим временем для рыбалки на озере Окичоби.

Фаготиста на английском языке с контекстными примерами

Испанский

A Principios de 2010 me reencontré con Marc Riera, fagotista y amigo mío del Esmuc, que es el intérprete de flabiol de la Cobla Sabadell, y le propuse de escribir y dedicarle una sardana Obligada de flabiol, con la petición de que su cobla me el estreno, y cuando recibí su acuerdo y el de su Cobla, me puse a trabajar en este desafío y con gran alegría ví que la cosa iba funcionando.

Английский

В начале 2010 года я встретился с Марком Риерой, фаготистом и моим другом из ESMUC, который является флабиолистом на Кобла Сабадель, и сделал ему предложение написать для него сардану «обязгада» (это сардана с одним инструментом, играющим сложный отрывок в качестве солиста, в данном случае флабиол), с просьбой, чтобы его кобла представила произведение, так что, когда я получил его согласие и согласие от коблы, я начал над ним работать.Я очень обрадовался, когда понял, что МОГУ ЭТО СДЕЛАТЬ. Наконец работа была закончена и состоялась премьера.

Последнее обновление: 2018-02-13
Частота использования: 1
Качество:
Ссылка: Andrm
Предупреждение: содержит невидимое форматирование HTML.

этнических групп в Испании | Кастильский, каталонский, баскский

Испания развивалась как нация с разнообразными этническими группами, которые жили на Пиренейском полуострове с древних времен.В современной Испании есть другие этнические группы, чем те, которые существовали на Пиренейском полуострове, из-за иммигрантов из стран Азии, Ближнего Востока, Европы и Африки. Этнические группы в Испании, которые жили в Испании с древних времен, включают:

• Арагонцы
• Андалузцы
• Астурийцы
• Баски
• Canary Islanders
• кастильцы
• Каталонцы
• Кантабрийцы
• Эстремадуранцы
• Галичане
• цыгане

Из них следующие являются крупнейшими этническими группами в Испании: кастильцев , каталонцев , басков , галичан и валенсийцев .

кастильцы

Королевство Кастилия и королевство Арагон на Пиренейском полуострове были объединены в современную Испанию. Этническая группа кастильцев в Испании является потомком Королевства Кастилия. После образования Королевства Испании кастильцы были одной из этнических групп в Испании, которые доминировали из-за их широкого присутствия по всему государству.

Культура кастильцев, а также их язык оказали такое влияние на испанскую культуру, что сегодня иностранцы считают кастильский язык испанским.Конституция Испании предоставила кастильскому языку официальный статус. Кастильская этническая группа в Испании в основном исповедует римско-католическую веру.

Каталонцы

Каталонцы представляют провинции северо-восточного региона Испании. Провинции, в которых сконцентрировано каталонское население, включают Барселону, Таррагону, Лериду и Жирону. Эти провинции вместе образуют автономное сообщество Испании под названием Каталония со столицей в Барселоне.Поскольку Каталония расположена недалеко от Франции, во Франции проживает несколько каталонцев.

Каталонцы обычно говорят на каталонском диалекте или валенсийском диалекте, который является вариантом каталонского. Каталонский язык является одним из официальных языков Испании, на нем также говорят каталонцы во Франции. Есть каталонцы, которые также общаются на испанском и французском языках.

Религия большинства каталонцев — католицизм, некоторые также исповедуют атеизм и агностицизм.Некоторые из важных аспектов каталонской традиции включают соревнования по строительству человеческих башен под названием Кастелл и танец Сардана.

Басков

Этническая группа басков в Испании существует уже несколько тысяч лет в регионе, который сейчас является частью современной Южной Франции и Северной Испании. Они считаются одной из древнейших этнических групп Европы. Баски в Испании сегодня сосредоточены в автономном сообществе Страна Басков и провинции Наварра.

В современной Испании проживает более двух миллионов басков. Этническая группа басков в Испании исповедует религию римского католицизма. Баски были связаны с сельскохозяйственной промышленностью. Это причина, по которой эта этническая группа в Испании работает на ранчо, в рыболовстве или на козьих фермах.

Галичане

Галичане называют северо-запад Пиренейского полуострова своим домом, где проживает около 3 миллионов галичан. Галичане произошли от второй волны кельтских захватчиков в Испанию с Британских островов, а также из Западной Европы, которые пришли примерно в 400 г. до н.э. через Пиренейские горы.

Римляне победили местное кельтское племя во втором веке до нашей эры, дав галичанам свое имя, которое произошло от латинского слова Gallaeci. Галичане известны своей любовью к еде, особенно к морепродуктам и рыбе, а также умением строить лодки. В Галисии по-прежнему преобладают сельское, сельское и сельское общество и образ жизни, где галицкий язык и культура процветают и сегодня.

Валенсийцы

Строго говоря, валенсийцы — это люди, которые проживают в валенсийском сообществе, но валенсийцы — это гораздо больше, чем просто место их проживания.Валенсийский язык официально является разновидностью каталонского, который описывается как отдельный диалект, но в Валенсии существуют разногласия по поводу его статуса, поскольку многие считают, что это язык сам по себе.

В течение 13 ^-го -го века Каталония изгнала мусульман из Валенсии, и в этот момент произошло рождение валенсийского языка, хотя неясно, произошел ли этот язык от арабских букв латинского алфавита или он появился раньше их правления до старой версии Окситанский.

В любом случае, на этом языке по-прежнему говорят и преподают в школах, и он широко распространен в городах на побережье. В настоящее время жители Валенсии работают в основном в туристических секторах, тепло обслуживая путешественников в этот регион, но они также являются домом для паэльи, ярких фестивалей и потрясающих произведений искусства.

Испанские диалекты

Узнайте больше о различных вариантах испанского языка, на которых говорят в разных странах.

Адаптерный белок метилтрансферазы Trm112 участвует в биогенезе обеих рибосомных субъединиц.

Abstract

Мы ранее идентифицировали Bud23 как метилтрансферазу, которая метилирует G1575 рРНК в P-сайте малой (40S) рибосомной субъединицы.В этой статье мы показываем, что Bud23 требует адаптерного белка метилтрансферазы Trm112 для стабильности in vivo. Делеция Trm112 приводит к bud23Δ -подобному мутантному фенотипу. Таким образом, Trm112 необходим для эффективного биогенеза малых субъединиц. Генетический анализ предполагает, что медленный рост мутанта trm112Δ обусловлен в первую очередь потерей Bud23. Неожиданно подавление bud23Δ -зависимого дефекта 40S выявило большой (60S) дефект биогенеза у мутанта trm112Δ .Используя седиментационный анализ в градиенте сахарозы и коиммунопреципитацию, мы показали, что Trm112 также участвует в биогенезе 60S субъединицы. Дефект 60S может зависеть от Nop2 и Rcm1, двух дополнительных взаимодействующих Trm112, которые мы идентифицировали. Наша работа расширяет известный диапазон функции Trm112 от модификации тРНК и факторов трансляции до обеих рибосомных субъединиц, показывая, что его эффекты охватывают все аспекты машины трансляции. Хотя Trm112 необходим для стабильности Bud23, наши результаты предполагают, что Trm112 не поддерживается в стабильном комплексе с Bud23.Мы предполагаем, что Trm112 стабилизирует своих свободных партнеров-метилтрансфераз, не взаимодействующих с субстратом, и / или помогает доставить своих партнеров-метилтрансфераз к их субстратам.

ВВЕДЕНИЕ

РНК играет ключевую роль во многих клеточных процессах. Следовательно, регуляция синтеза, сворачивания и процессинга видов РНК является неотъемлемой частью регуляции клеточных функций. Посттранскрипционные модификации во время процессинга возникающих транскриптов РНК-предшественников уже давно предполагается, что они являются механизмами, которые модулируют функцию или стабильность РНК и влияют на экспрессию генов (Helm, 2006).Метилирование РНК — одна из таких часто наблюдаемых модификаций, о которой сообщалось в рРНК, тРНК, мРНК, малой ядерной РНК, малой ядрышковой РНК (мяРНК), тмРНК и микроРНК, а также вирусной РНК. Метилирование РНК может происходить в различных положениях азотистого основания, а также в сахаре рибозы.

рРНК подвергаются нескольким посттранскрипционным модификациям, в частности метилированию оснований, метилированию 2′- O -рибозы и псевдоуридилированию. Большинство этих модификаций локализовано в функционально важных центрах рибосомы — центре пептидилтрансферазы и центре декодирования (Decatur and Fournier, 2002).Однако большой процент этих модификаций рРНК не является существенным по отдельности и, как считается, регулирует эффективность и точность процесса трансляции. В то время как большинство модификаций рРНК представляют собой метилирование и псевдоуридилирование 2′- O -рибозы, на которые нацелены мяноРНК C / D-box и snoRNA H / ACA-box с использованием обычных модифицирующих ферментов, метилирование оснований обычно катализируется специфическим S — аденозилметионин (SAM) -зависимые метилтрансферазы (Henras et al., 2008).

Маленькая субъединица (40S) 18S рРНК в Saccharomyces cerevisiae содержит только три метилирования оснований. Два из них, в положениях A1781 и A1782, катализируются Dim1 (Lafontaine et al. , 1994). Dim1 важен для жизнеспособности, но не катализируемое им метилирование (Lafontaine et al. , 1995). Третье основание, метилирование в положении G1575, катализируется Bud23 (White et al. , 2008). Метилированный гуанозин расположен в Р-сайте малой субъединицы, и его метилирование сохраняется у всех эукариот.Однако, подобно Dim1 и несмотря на его, по-видимому, важное расположение, метилирование G1575 также несущественно (White et al. , 2008). Большая субъединица (60S) 25S рРНК содержит по крайней мере шесть метилирований оснований (Piekna-Przybylska et al. , 2007), но ни одна из метилтрансфераз, ответственных за эти модификации, не охарактеризована.

РНК переноса также претерпевают множество модификаций, включая метилирование нескольких оснований. Метилтрансферазы, ответственные за некоторые из этих метилирований, были идентифицированы (Dunin-Horkawicz et al., 2006). Интересно, что по крайней мере две из SAM-зависимых тРНК метилтрансфераз (Trm9 и Trm11), как было показано, взаимодействуют с маленьким белком цинкового пальца Trm112 (Purushothaman et al. , 2005; Studte et al. , 2008). Кроме того, было показано, что Trm112 является коактиватором Mtq2, белка, который метилирует фактор терминации трансляции, eRF1 (Heurgue-Hamard et al. , 2006; Liger et al. , 2011). В случае Mtq2 для его стабильности также требуется Trm112.Все известные метилтрансферазы-партнеры Trm112 относятся к одному семейству из семи белков β-цепи. Таким образом, Trm112, по-видимому, играет общую роль в облегчении функции множественных метилтрансфераз, влияющих на разные аспекты трансляции.

В этой работе мы предоставляем доказательства, что Trm112 также действует в биогенезе рибосом, как коактиватор для Bud23 в биогенезе 40S и в биогенезе 60S, вероятно, через Nop2 и Rcm1. Наша работа раскрывает новую роль Trm112 в биогенезе рибосом и расширяет функцию Trm112 на все аспекты аппарата трансляции: две субъединицы рибосомы, тРНК и факторы трансляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Bud23 и Trm112 взаимодействуют in vivo

Мы ранее идентифицировали Bud23 как метилтрансферазу, участвующую в биогенезе небольшой (40S) рибосомной субъединицы (White et al. , 2008). Чтобы дополнительно охарактеризовать функцию Bud23, мы провели тандемную аффинную очистку (TAP) для выявления взаимодействующих партнеров. В дополнение к известным факторам, связанным с 40S, мы идентифицировали Trm112 (неопубликованные данные). Это взаимодействие было интригующим, поскольку было показано, что Trm112 является «узловым» белком, который взаимодействует по крайней мере с тремя метилтрансферазами, влияя на различные аспекты трансляции, путем модификации тРНК и фактора трансляции (Mazauric et al., 2010; Liger et al. , 2011). Взаимодействие с Bud23 д. Вовлекать Trm112 также в биогенез рибосом. Мы подтвердили физическое взаимодействие между Bud23 и Trm112 двумя способами: коиммунопреципитацией и дрожжевым двугибридным анализом. Bud23 с С-концом, меченный TAP, экспрессировался в штамме, содержащем геномный Trm112, меченный зеленым флуоресцентным белком (GFP) с С-конца. Все экстракты подвергали иммунопреципитации против TAP-метки с использованием иммуноглобулина G (IgG) -сефарозы и анализировали на Trm112-GFP с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против GFP.Rps8 использовали в качестве положительного контроля для очистки Bud23-TAP, поскольку Bud23 ассоциируется с частицами pre-40S. Trm112-GFP специфически иммунопреципитировали с помощью Bud23, меченного TAP ().

Bud23 и Trm112 взаимодействуют in vivo. (A) Bud23-TAP иммунопреципитирует Trm112-GFP. Экстракты из клеток, экспрессирующих Trm112-GFP (AJY3446) и Bud23-TAP (pAJ2558), подвергали иммунопреципитации с помощью IgG-сефарозы. Экстракты, полученные из клеток, экспрессирующих Trm112-GFP и немеченый Bud23, использовали в качестве отрицательного контроля. Иммунопреципитированные белки подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу с использованием антител против GFP-пероксидазы хрена и антител против Rps8 для обнаружения Trm112-GFP и Rps8 соответственно.(B) Штамм PJ69-4α, содержащий Trm112-Gal4BD (pAJ2895) и Gal4AD-Bud23 (pAJ2768), накладывали на планшеты Leu-Trp и Leu-Trp-His. Соответствующие контроли, содержащие соответствующие пустые векторы, также накладывали на планшеты для селекции, чтобы исключить возможность самоактивации репортера HIS3. Планшеты инкубировали при 30 ° C в течение 2 дней.

Для тестирования двухгибридного взаимодействия мы клонировали Trm112 с C-концевым слиянием ДНК-связывающего домена Gal4 в pGBKT7 и Bud23 с N-концевым слиянием домена активации Gal4 в pACT2.Мы наблюдали положительное двухгибридное взаимодействие между Bud23 и Trm112, о чем свидетельствует рост на среде без гистидина (). Таким образом, коиммунопреципитация и двухгибридный анализ дрожжей подтверждают результат масс-спектроскопии, согласно которому Bud23 и Trm112 взаимодействуют in vivo. Хотя мы не можем исключить возможность того, что их взаимодействие перекрывается третьим белком, известно, что Trm112 напрямую связывается с другими семью β-нитевыми метилтрансферазами. Таким образом, вероятно, что Bud23 напрямую связывает Trm112. Действительно, пока эта работа продолжалась, сообщалось о прямом комплексе Bud23 и Trm112 (Figaro et al., 2012).

Bud23 и Trm112 демонстрируют положительное генетическое взаимодействие

Белки, участвующие в одних и тех же или родственных путях, часто проявляют генетические взаимодействия. Чтобы проверить генетическое взаимодействие между Bud23 и Trm112, мы сравнили скорости роста одинарных мутантов bud23Δ и trm112Δ дикого типа и двойного мутанта bud23Δ trm112Δ дикого типа. Удаление BUD23 или TRM112 привело к серьезному дефекту роста (панели 1–3).Однако двойной мутант рос примерно с той же скоростью, что и отдельные одиночные мутанты (см. Панель 4). Количественные скорости роста определяли в жидких культурах. Пригодность рассчитывалась как время удвоения дикого типа, деленное на время удвоения мутанта. Если бы не было генетического взаимодействия, то можно было бы ожидать, что двойной мутант будет расти с приспособленностью, рассчитанной как произведение индивидуальных приспособлений одиночных мутантов (Dixon et al. , 2009). bud23Δ показал пригодность 0.30 по сравнению с диким типом, и trm112Δ имел приспособленность 0,27. При отсутствии генетического взаимодействия можно ожидать, что двойной мутант bud23Δ trm112Δ будет расти с приспособленностью 0,08 (0,30 × 0,27). Однако двойной мутант рос с приспособленностью 0,29, демонстрируя на 72% более высокую приспособленность, чем ожидалось, и указывает на сильное положительное генетическое взаимодействие ().

Bud23 и Trm112 показывают положительное генетическое взаимодействие. (A) Десятикратные серийные разведения изогенного дикого типа (BY4741), trm112Δ (AJY3517) и bud23Δ (AJY2161) одиночных мутантов, trm112Δ bud23Δ (AJY3524) двойного мутанта (utp -A2375G) и53 bud (AJY3524) AJY3549) и trm112Δ utp14-A758G (AJY3547) мутанты помещали на полную богатую среду (YPD) и инкубировали при 30 ° C в течение 2 дней.(B) Количественное определение скорости роста мутантов, показанных на (A). Штаммы выращивали в 96-луночных планшетах в полностью обогащенной среде (YPD) при 30 ° C и непрерывно контролировали плотность в течение 36 часов. Пригодность каждого штамма рассчитывали путем деления времени удвоения изогенного штамма дикого типа на время удвоения мутанта. Ожидаемую приспособленность двойных мутантов к отсутствию генетического взаимодействия рассчитывали как произведение наблюдаемой приспособленности отдельных мутантов. (C) trm112Δ и bud23Δ мутанты демонстрируют аналогичную неправильную локализацию Utp14.Указанные штаммы, экспрессирующие геномный Utp14-GFP дикого типа или utp14-A758G -GFP, выращивали в синтетической полной среде до средней логарифмической фазы при 30 ° C и анализировали на флуоресценцию GFP. Ядра окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; здесь ложно окрашены в красный цвет).

Мы идентифицировали мутацию в UTP14 (A758G), кодирующую компонент процессома малой субъединицы в качестве экстрагенного супрессора дефекта роста bud23Δ (, панель 5; неопубликованные данные). Эта мутация в UTP14 также подавляла мутант trm112Δ (см. Панель 6 и).Более того, Utp14-GFP неправильно локализован из ядрышка в нуклеоплазму у мутанта trm112Δ аналогично тому, как это наблюдается у мутанта bud23Δ (; неопубликованные данные). Эта неправильная локализация может быть исправлена ​​как в мутанте bud23Δ , так и в мутанте trm112Δ с помощью супрессора utp14-A758G. Таким образом, мы заключаем, что Bud23 и Trm112 функционально взаимодействуют друг с другом и что мутанты дефектны для одной и той же стадии биогенеза 40S рибосом.

То, что bud23Δ и trm112Δ демонстрируют сильное положительное генетическое взаимодействие, и что серьезный дефект роста trm112Δ частично подавляется мутацией, которая подавляла bud23Δ , предполагает, что большая часть дефекта роста trm112Δ вызвана сбой в функции Bud23.Это довольно удивительно, учитывая, что Trm112 взаимодействует с множественными метилтрансферазами, участвующими во множестве аспектов трансляции.

Trm112 необходим для биогенеза 40S и 60S рибосом

Анализ профиля полисом с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы является чувствительным анализом для мониторинга биогенеза рибосом и дефектов трансляции. Мы использовали анализ полисом для анализа дефектов биогенеза рибосом в trm112Δ . Как сообщалось ранее, мутант bud23Δ обнаруживает сильный дефект биогенеза 40S, приводящий к сильному дисбалансу субъединиц с почти отсутствием свободных 40S, очень высокими уровнями свободных 60S и уменьшенным количеством полисом ().Мутант trm112Δ также обнаружил дефект биогенеза 40S; однако степень дисбаланса субъединиц была менее серьезной, чем у мутанта bud23Δ . Мы отмечаем, что дисбаланс субъединиц в этом штамме меньше, чем недавно сообщалось для trm112Δ (Figaro et al. , 2012). Однако мы наблюдали аналогичные профили от множественных клонов спор после спорулирования гетерозиготного диплоида trm112 (неопубликованные данные), предполагая, что этот профиль специфически отражает потерю TRM112 на фоне этого штамма.Мы также проанализировали trm112Δ , содержащий супрессор utp14-A758G. Неожиданно этот мутант обнаружил дефект биогенеза 60S, о чем свидетельствует обратный дисбаланс свободных субъединиц (уровни свободных 60S ниже, чем 40S) и полисомы полумеров. Полумеры содержат инициирующие комплексы 43S, к которым еще не присоединились субъединицы 60S, и которые являются обычным следствием снижения уровней 60S. Эти результаты предполагают, что Trm112 играет роль в путях биогенеза как 40S, так и 60S; однако дефект 40S более выражен, чем дефект биогенеза 60S у мутанта trm112Δ .

Trm112 необходим как для 40S, так и для 60S биогенеза. (A) trm112Δ мутант обнаруживает дефект биогенеза как малой, так и большой субъединицы. Экстракты целых клеток из контроля дикого типа (AJY2643), bud23Δ (AJY2161), trm112Δ (AJY3517), trm112Δ bud23Δ (AJY3524) и Y trm112Δ utp14-A758G (штамм Y trm112Δ utp14-A758G) были подвергнуты воздействию ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Поглощение при 254 нм использовали для создания профилей полисом. Отмечено положение пиков и полумеров 40S, 60S и 80S.(B) trm112Δ мутант проявляет дефект процессинга как малой, так и большой субъединицы рРНК. Суммарная РНК, экстрагированная из указанных штаммов, выросших до OD ₆₀₀ ∼ 0,3 в YPD при 30 ° C, была разделена на денатурирующем геле агароза / формальдегид, перенесена на мембрану и исследована гибридизацией с указанными олигонуклеотидными зондами для идентификации промежуточных продуктов процессинга рРНК. . Олигонуклеотидные зонды, используемые для Нозерн-блоттинга, перечислены в. (C) Количественное определение Нозерн-блотов, показанных на (B).Сигналы гибридизации детектировали с помощью фосфорного изображения и количественно оценивали с помощью Quantity One (Bio-Rad). Сигналы были нормализованы к U2 в качестве контроля загрузки, а числа указывают уровни по отношению к дикому типу (относительно WT).

Мы также сравнили эффект делеции TRM112 и BUD23 на процессинг рРНК. Bud23 необходим для эффективного расщепления по A2, которое дает промежуточное соединение 27SA2 (White et al. , 2008; неопубликованные данные). Действительно, оба мутанта сильно ингибировали расщепление А2.Оба мутанта также показали пониженные уровни зрелой 18S рРНК по сравнению с контролем дикого типа: bud23Δ продемонстрировал снижение на 61%, а trm112Δ — снижение на 56% 18S рРНК при нормализации до U2 (). Однако мы отметили, что мутант trm112Δ также демонстрировал снижение на 43% уровня 25S рРНК 60S субъединицы (и). Одновременное восстановление 18S и 25S рРНК в мутанте trm112Δ , вероятно, объясняет относительно нормальный баланс субъединиц, наблюдаемый в полисомном профиле мутанта trm112Δ ().Сходный дефект расщепления 27SA2 указывает на то, что Bud23 и Trm112 имеют общую функцию в расщеплении A2. Кроме того, сниженные уровни 25S и анализ профиля полисома позволяют предположить, что Trm112 также необходим для эффективной обработки 25S.

Седиментация Trm112 не зависит от Bud23

Из-за взаимодействия между Trm112 и Bud23 мы исследовали их седиментацию на градиентах сахарозы, чтобы определить, совмещаются ли они, что свидетельствует о стабильном комплексе in vivo.Экстракты получали из клеток, экспрессирующих TAP-меченый Trm112 и эписомально экспрессируемый Bud23, и подвергали центрифугированию в градиенте плотности сахарозы. Мы использовали две разные версии Bud23, помеченные как на N-, так и на C-конце. Trm112-TAP оседал в положении 60S, тогда как меченный на N-конце Bud23 находился преимущественно в положении 90S, перекрываясь с маркером 90S Mpp10 (вверху). Небольшое количество Trm112 также присутствовало в верхней части градиента. С другой стороны, Bud23, меченный С-концом, осаждается в положении 40S (, внизу).Недавняя работа с использованием антител против нативного комплекса Bud23-Trm112 показала, что оба белка совместно оседают в положении 80S / 90S, предполагая, что два белка существуют в стабильном комплексе (Figaro et al. , 2012). Хотя обе меченые версии Bud23 и Trm112-TAP, использованные в нашем исследовании, являются функциональными, природа метки и / или конца меченного белка оказывает сильное влияние на седиментацию белков. Тем не менее, тот факт, что обе меченые версии Bud23 были функциональными и ни одна из них не совмещалась с Trm112-TAP в наших экспериментах, демонстрирует, что эти два белка не всегда сосуществуют в стабильном комплексе, несмотря на то, что Trm112 необходим для стабильности Bud23 (см. ниже и позже в статье).

Осадки Trm112 и Bud23 с различными комплексами. Цельноклеточные экстракты обработанного циклогексимидом AJY3125, экспрессирующего геномный Trm112-TAP, и эписомальной двугибридной конструкции Bud23 (N-концевой GAL4BD-myc-меченый Bud23; вверху) или C-концевой GFP-меченный Bud23 (внизу) подвергали воздействию сахарозы. ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Белки осаждали из фракций, подвергали SDS-PAGE, и меченный myc Bud23, меченный GFP Bud23, Rps8, Rpl8 и Mpp10 детектировали с использованием anti-myc, anti-GFP, anti-Rps8, anti-Rpl8 и anti -Mpp10 антитела соответственно.Trm112, меченный TAP, был обнаружен по его перекрестной реактивности с анти-Rps8 и анти-Rpl8, а также с антителами против Mpp10. Указаны положения 40S, 60S и 80S.

Trm112 влияет на стабильность in vivo некоторых, но не всех партнеров по взаимодействию. (A) Отсутствие Trm112 влияет на стабильность in vivo Bud23 и Mtq2, но не Nop2, Rcm1 или Trm11. Клетки дикого типа (AJY2643) или trm112Δ (AJY3517), экспрессирующие Bud23-13myc (pAJ2192), Nop2-13myc (pAJ2875), Rcm1-13myc (pAJ2878), Trm11-13myc (pAJ2876) или Mtq2-13myc) из плазмиды выращивали на селективных средах.Клетки, соответствующие 2,5 OD ₆₀₀ единиц из лог-фазовых культур, собирали и подвергали щелочному лизису с последующим вестерн-блоттингом. Белки, меченные Myc, детектировали с использованием антител против myc. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PDH) была обнаружена в качестве контроля с использованием антитела против G6PDH. (B) Сверхэкспрессия Trm112 стабилизирует Bud23 in vivo. Клетки дикого типа (AJY2643), экспрессирующие плазмидный Bud23-GFP (pAJ2151) и индуцибельный галактозой Trm112 (pAJ2583) или пустой вектор, выращивали в течение ночи в селективных средах, содержащих галактозу, при 30 ° C.Культуры разводили в селективных средах, содержащих галактозу, до OD ₆₀₀ ∼ 0,1. Клетки из лог-фазовых культур, соответствующих 2,5 OD ₆₀₀ единиц, собирали через 6 и 24 часа роста. Клетки лизировали щелочной обработкой, а белки определяли вестерн-блоттингом. Bud23-GFP, Trm112-zz и G6PDH детектировались антителами против GFP, пероксидаза-антипероксидаза (PAP) и анти-G6PDH соответственно.

Затем мы исследовали, зависело ли осаждение Trm112 от присутствия Bud23.Trm112 присутствует на вершине градиента и в области 60S, независимо от присутствия или отсутствия Bud23 (), указывая на то, что его седиментация не зависит от Bud23. Чтобы подтвердить, что Trm112-TAP действительно осаждается с 60S, мы затем запускали градиенты для Trm112-TAP в диссоциативных условиях и отслеживали осаждение Mpp10 в качестве маркера 90S, Nop2 в качестве маркера до 60S, Rpl10 в качестве маркера 60S и Rps8. как маркер 40S. В этих условиях Trm112 наиболее близко коседиментируется с Rpl10 и Nop2 в положении 60S, а не в положении 40S или 90S ().Чтобы подтвердить очевидную ассоциацию Trm112 с субъединицами пре-60S или 60S, мы провели анализ рРНК пре-60S, ассоциированных с Trm112. В соответствии с седиментационным анализом, Trm112-TAP эффективно сбрасывает 27S и 7S пре-рРНК, а также зрелую 25S рРНК, но не 20S пре-РНК или U3 snoRNA (). Относительное обогащение 27S и 7S было намного больше, чем 25S, что позволяет предположить, что Trm112 преимущественно связан с частицей до 60S. Ассоциация Trm112 с пре-60S или 60S субъединицами была подтверждена коиммунопреципитацией 60S белка Rpl8 ().Коиммунопреципитация рРНК пре-60S с Trm112 согласуется с седиментацией Trm112 в положении 60S и предполагает, что Trm112 преимущественно ассоциирован с видами до 60S.

Trm112-TAP преимущественно отложения с 60S. (A) На осаждение Trm112 не влияет присутствие или отсутствие Bud23. Экстракты целых клеток, полученные из обработанных циклогексимидом AJY3560 (Trm112-TAP дикого типа Bud23) и AJY3125 (Trm112-TAP bud23Δ ), подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы.Образцы подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу, как описано в. (B) Отложения Trm112 преимущественно при 60S в диссоциативных градиентах. Экстракт цельных клеток из AJY3560, экспрессирующего Nop2-13myc (pAJ2895) из плазмиды, получали в условиях диссоциации рибосомных субъединиц и фракционировали после ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Nop2-13myc и Rpl10 были обнаружены с использованием антител против myc и против Rpl10 соответственно. Все остальные белки были обнаружены, как описано в легенде к.

Trm112 иммунопреципитирует РНК пре-60S и ассоциированные метилтрансферазы. (A) Trm112-TAP иммунопреципитирует 60S-ассоциированные пре-рРНК. Экстракты из клеток, экспрессирующих Trm112-TAP (AJY3560), иммунопреципитировали с помощью IgG-сефарозы. Экстракт, полученный из клеток, экспрессирующих немеченый Trm112, использовали в качестве отрицательного контроля. Иммунопреципитированные РНК анализировали на наличие U3 snoRNA или специфических пре- и зрелых рРНК с помощью нозерн-блоттинга. Олигонуклеотидные зонды, используемые для Нозерн-блоттинга, перечислены в.(B) Trm112-TAP коиммунопреципитирует связанные с пре-60S метилтрансферазы, Nop2 и Rcm1. Экстракты из клеток, экспрессирующих геномный Trm112-TAP (AJY3560) и плазмидный Nop2-13myc (pAJ2875), Rcm1-13myc (pAJ2878) или пустой вектор, подвергали иммунопреципитации с помощью IgG-сефарозы. Иммунопреципитированные белки подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу с использованием антител против myc и против Rpl8 для обнаружения Nop2-13myc или Rcm1-13myc и Rpl8 соответственно.

Trm112 коиммунопреципитирует связанные с 60S метилтрансферазы Nop2 и Rcm1

Ассоциация Trm112 с субъединицами 60S и потребность в Trm112 для эффективного производства 60S (и) предполагает, что Trm112 имеет дополнительных партнеров в биогенезе 60S.Поскольку было показано, что Trm112 взаимодействует с множеством метилтрансфераз, мы решили проверить, взаимодействует ли Trm112 с дополнительными известными и не охарактеризованными метилтрансферазами, которые, как предполагается, играют роль в биогенезе 60S. Мы протестировали Rrp8, Ybr141c, Ylr063w, Nop2, Ybr271w, Rcm1 и Spb1 на взаимодействие с Trm112 путем коиммунопреципитации. Кандидаты в метилтрансферазы с С-концом, меченные myc, экспрессировали в штамме, содержащем геномный Trm112, меченный TAP на С-конце. Все экстракты подвергали иммунопреципитации против TAP-метки с использованием IgG-сефарозы и анализировали на myc-меченые белки с помощью вестерн-блоттинга.Trm112-TAP специфически иммунопреципитировал две 60S-родственные метилтрансферазы, Nop2 и Rcm1 (). Таким образом, анализ коиммунопреципитации показывает, что Trm112 специфически взаимодействует с Nop2 и Rcm1 in vivo.

Trm112 влияет на стабильность in vivo некоторых, но не всех, своих партнеров по взаимодействию

Предыдущая работа показала, что взаимодействие с Trm112 солюбилизирует Mtq2 и Trm9 в экстрактах Escherichia coli (Heurgue-Hamard et al. , 2006 ; Чен и др., 2011). Чтобы проверить влияние Trm112 на уровни Bud23, Nop2 и Rcm1 in vivo, мы изучили стационарные уровни этих белков в клетках дикого типа и мутантных клетках trm112Δ . Мы также рассмотрели уровни Mtq2 и Trm11 в качестве контроля для белков, которые ранее были охарактеризованы как партнеры по взаимодействию с Trm112. Наши результаты показывают, что отсутствие Trm112 оказывает драматическое влияние на стабильность in vivo некоторых, но не всех его партнеров по взаимодействию (). В частности, мы наблюдали, что Bud23 и Mtq2 были сильно восстановлены в мутанте trm112Δ .Однако уровни Nop2, Rcm1 и Trm11 были умеренно или совсем не затронуты отсутствием Trm112. Для дальнейшего изучения влияния уровней Trm112 на стационарные уровни Bud23 мы исследовали Bud23-GFP в штамме, экспрессирующем Trm112 под контролем индуцируемого галактозой промотора на плазмиде. Затем мы сравнили уровни Bud23-GFP в присутствии или в отсутствие сверхэкспрессированного Trm112 (). В отсутствие сверхэкспрессии TRM112 уровни Bud23 в насыщенных культурах были существенно снижены (сравните дорожки 2 и 1).Это ожидается для большинства факторов, участвующих в биогенезе рибосом. Однако сверхэкспрессия Trm112 приводила к повышенным уровням Bud23-GFP в растущих и насыщенных культурах (сравните дорожки 3 и 1 и дорожки 4 и 2), предполагая, что уровни Bud23 в клетках частично зависят от уровня Trm112.

Специфические мутации в Bud23 приводят к потере взаимодействия Trm112-Bud23

Мы мутировали кластеры открытых остатков на Bud23 и тестировали на потерю взаимодействия с Trm112 с помощью двухгибридного анализа, как описано в.Мутант bud23-RSD (R107L, S110A, D112G) привел к полной потере детектируемого взаимодействия (). Мы смоделировали предсказанную структуру домена метилтрансферазы Bud23 (White et al. , 2008) на недавно описанной кристаллической структуре Mtq2-Trm112 (Liger et al. , 2011;). Хотя только R107 находится на интерфейсе в смоделированной структуре, петля Trm112 (aa 32–35) не разрешается в структуре Mtq2-Trm112 и, таким образом, может взаимодействовать с дополнительными остатками Bud23.Утрата двухгибридного взаимодействия не объяснялась потерей мутантного белка Bud23, поскольку уровни мутантного белка Bud23-RSD были лишь незначительно снижены по сравнению с белком дикого типа (). Однако двугибридная конструкция была вектором с высокой копией и сверхэкспрессировала Bud23. Следовательно, мы переключили мутант bud23-RSD на вектор с низкой копией, чтобы более точно воспроизвести эндогенную экспрессию Bud23, и исследовали его способность комплементировать мутант bud23Δ . В этом анализе мутант bud23-RSD оказался полностью нефункциональным ().Кроме того, мы наблюдали серьезное снижение уровня мутантного белка при экспрессии из низкокопийного вектора (), что было аналогично тому, которое наблюдалось для Bud23 дикого типа в мутанте trm112Δ (). Таким образом, мы заключаем, что специфическое взаимодействие с Trm112 является критическим для стабильности и, следовательно, функции Bud23 in vivo.

Взаимодействие Bud23-Trm112 является биологически значимым. (A) Специфические мутации в Bud23 приводят к потере двугибридного взаимодействия Bud23-Trm112. Штамм PJ69-4α, содержащий мутант Trm112-Gal4BD (pAJ2895) и Gal4AD-Bud23 (pAJ2768) или Gal4AD-Bud23-RSD (pAJ2907) на плазмидах, накладывали на планшеты Leu-Trp и Leu-Trp-His.Соответствующие элементы управления (описанные в) также были исправлены параллельно. Планшеты инкубировали при 30 ° C в течение 2 дней. (B) Смоделированная Bud23 структура (aa 1-219) вручную стыкована с недавней структурой Encephalitozoon cuniculi Trm112-Mtq2 (PDB 3Q87). Trm112 — пурпурный, Bud23 — голубой, SAM — оранжевый, мутантные остатки в Bud23 (R107, S110 и D112) обозначены пунктирными сферами зеленого цвета. (C) Потеря двухгибридного взаимодействия не объясняется потерей уровня белка. Штамм PJ69-4α, содержащий Trm112-Gal4BD (pAJ2895) и Gal4AD-Bud23 (pAJ2768) или Gal4AD-Bud23-RSD (pAJ2907) на 2 мкг (высококопийных) плазмидах, используемых в, выращивали в среде Leu-Trp.Клетки, соответствующие 2,5 OD ₆₀₀ единиц из лог-фазовых культур, подвергали щелочному лизису. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и подвергали вестерн-блоттингу. Gal4AD-гемагглютинин-Bud23 и Trm112-Gal4BD-myc были обнаружены антителами против гемагглютинина (HA) и против myc соответственно. (D) Неспособность взаимодействовать с Trm112 приводит к потере биологической активности Bud23. Мутант bud23Δ (AJY2161), содержащий пустой вектор, мутант Bud23 дикого типа (pAJ2154) или мутант Bud23-RSD (pAJ2798) анализировали на функцию путем комплементации роста.Десятикратные серийные разведения нормализованных лог-фазовых культур наносили на синтетические среды без лейцина. Планшеты инкубировали при 30 ° C в течение 2 дней. (E) Неспособность взаимодействовать с Trm112 приводит к снижению стабильности Bud23 in vivo. bud23Δ мутант (AJY2161), содержащий N-концевой myc-меченный Bud23 дикого типа (pAJ2892) или мутант Bud23-RSD (pAJ2894), на низкокопийных плазмидах выращивали в селективных средах без лейцина. Клетки, соответствующие 2,5 OD ₆₀₀ единиц из лог-фазовых культур, подвергали щелочному лизису.Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и подвергали вестерн-блоттингу. myc-Bud23 был обнаружен антителами против myc. G6PDH детектировали с использованием антитела против G6PDH в качестве контроля нагрузки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Дрожжи Trm112 — это небольшой белок цинкового пальца массой 15 кДа, который, как было показано, связывается и регулирует каталитическую активность и стабильность нескольких метилтрансфераз, участвующих в различных аспектах трансляции (Purushothaman et al. , 2005; Heurgue -Hamard и др. , 2006 г .; Mazauric и др., 2010; Liger et al. , 2011). К ним относятся Trm9 и Trm11, которые отвечают за метилирование тРНК (Purushothaman et al. , 2005; Mazauric et al. , 2010), и Mtq2, который отвечает за метилирование фактора терминации трансляции eRF1 (Heurgue- Hamard и др. , 2006; Лигер и др. , 2011). Наша работа расширяет функцию Trm112 до биогенеза обеих субъединиц рибосом посредством его взаимодействия с малой субъединицей метилтрансферазой Bud23 и, вероятно, через Nop2 и Rcm1, действующие на большую субъединицу.В ходе этой работы о подобной функции Trm112 в функции Bud23 сообщили Figaro et al. (2012).

Как Trm112 влияет на функцию своих партнеров метилтрансферазы?

Ранее было показано, что Trm112 необходим для растворимости Mtq2 и Trm9 (Heurgue-Hamard et al. , 2006; Mazauric et al. , 2010). В этом исследовании мы показываем, что Trm112 необходим для стабильности Bud23 in vivo. Несмотря на то, что Bud23 необходим для высококонсервативного метилирования G1575 в 18S рРНК, для биогенеза рибосом и нормального клеточного роста важен белок, а не его метилтрансферазная активность как таковая (White et al., 2008 г .; Фигаро и др. , 2012). Уровни Bud23 практически не обнаруживаются в отсутствие Trm112 и повышаются за счет сверхэкспрессии Trm112. Фигаро и др. (2012) продемонстрировал аналогичные результаты и расширил эту работу, продемонстрировав, что два белка образуют стабильный комплекс in vitro и совмещаются с градиентами плотности сахарозы в положении 90S прерибосомной частицы. Мы исследовали седиментационное поведение Trm112 и Bud23, используя меченые версии белков.Мы воспользовались тем фактом, что метки по-разному влияют на осаждение Bud23; Bud23, содержащий GAL4-связывающий домен, слитый с N-концом, оседает на 90S, тогда как он осаждается на 40S с GFP, слитым с C-концом. Оба слитых белка функционируют in vivo. Таким образом, мы могли использовать эти меченые Bud23 белки, чтобы исследовать зависимость седиментации Trm112 от Bud23. Мы обнаружили, что меченые Bud23 и Trm112 не совмещаются, и что на седиментацию Trm112 не влияет присутствие или отсутствие Bud23.Эти результаты показывают, что Trm112 и Bud23 не поддерживаются в стабильном комплексе, несмотря на тот факт, что стабильность Bud23 зависит от присутствия Trm112. Вместе эти результаты подтверждают, что временное взаимодействие между Bud23 и Trm112 достаточно для стабильности Bud23. Это можно объяснить, если Trm112 стабилизирует свободный Bud23, который не взаимодействует с субстратом. Trm112 также может играть важную роль в доставке Bud23 к его субстрату. Сообщается, что Trm112 экспрессируется в количестве 4800 молекул на клетку, тогда как Mtq2, Bud23, Trm9 и Trm11 вместе взятые составляют 8900 молекул на клетку (Ghaemmaghami et al., 2003). Это помимо дополнительных взаимодействий Trm112 с Dhr1 (Krogan и др. , 2006), Lys9 (Mazauric и др. , 2010), Sfh2 (Yu и др. , 2008) и Nop2 и Rcm1, идентифицированных здесь. . Таким образом, кажется маловероятным, что в клетке имеется достаточно Trm112 для одновременного связывания всех ее партнеров, что согласуется с выводом, что Trm112 не остается в стабильном комплексе с Bud23. Это может быть общим свойством того, как Trm112 взаимодействует со своими партнерами-метилтрансферазами в клеточном контексте.

Trm112 взаимодействует с множеством метилтрансфераз, участвующих в различных аспектах функции рибосом. Однако мутанты trm112Δ и bud23Δ демонстрируют сильное положительное генетическое взаимодействие: двойной мутант растет практически с той же скоростью, что и отдельные одиночные мутанты. Это согласуется с почти полной потерей Bud23 из клеток, лишенных Trm112; если Bud23 нестабилен в мутанте trm112Δ , не ожидается, что делеция BUD23 ухудшит фенотип.Мы смоделировали предсказанную структуру Bud23 (White et al. , 2008; Figaro et al. , 2012) на недавней кристаллической структуре Mtq2-Trm112 (Liger et al. , 2011). Затем мы мутировали группы соседних открытых остатков и проверили потерю взаимодействия. Мутация кластера остатков R107, S110, D112 приводила к потере взаимодействия с Trm112 и потере функции Bud23. Хотя мутантный белок экспрессировался на уровнях, близких к уровням дикого типа при сверхэкспрессии в двугибридной конструкции, белок не обнаруживался при экспрессии из низкокопийного центромерного вектора, что согласуется с нашим выводом о том, что взаимодействие Trm112 необходимо для поддержания Bud23. .Интересно, что Фигаро и др. (2012) отметили, что мутант rid2-1 в гомологе Arabidopsis Bud23 соответствует положению R107. rid2-1 является мутантом с частичной потерей функции, который обнаруживает дефекты процессинга рРНК, согласующиеся с дефектом Bud23-подобной функции (Ohbayashi et al. , 2011). Поскольку R107 находится в кластере остатков, влияющих на взаимодействие Bud23 с Trm112 в дрожжах, вполне вероятно, что мутант rid2-1 специфически дефектен для взаимодействия с гомологом Arabidopsis Trm112.

Расширение функции Trm112 на биогенез обеих субъединиц рибосомы

Тот факт, что мы могли частично подавить дефект роста мутанта trm112Δ с помощью мутации utp14, которую мы идентифицировали как супрессор bud23Δ , предполагает, что значительный компонент дефекта роста мутанта trm112Δ происходит из-за потери Bud23. Специфическая функция UTP14 в биогенезе рибосом неизвестна, и мы в настоящее время изучаем механизм того, как utp14-A758G подавляет мутант bud23Δ .Интересно, что подавление trm112Δ с помощью мутации utp14 выявило лежащий в основе дефект биогенеза 60S, который также проявлялся в недостаточной аккумуляции 25S рРНК в одном только мутанте trm112Δ . Эти результаты показывают, что Trm112 играет роль в биогенезе 60S помимо своей роли в биогенезе 40S посредством Bud23. Мы обнаружили, что Trm112-TAP осаждается в основном в положении 60S, а не 90S или до 40S. Это согласуется с тем, что Trm112 играет роль в биогенезе 60S и его взаимодействии с Nop2 и Rcm1 (сообщается здесь) и дополнительными факторами 60S (сообщается Figaro et al ., 2012). В самом деле, обогащение pre-60S 27S и 7S РНК с помощью Trm112 строго подтверждает роль Trm112 в биогенезе 60S. Однако седиментация Trm112-TAP при 60S отличается от того, что сообщалось для нативного Trm112, который оседал при 90S (Figaro et al. , 2012). Хотя в наших экспериментах мы использовали Trm112 с меткой TAP, эта версия Trm112 с меткой демонстрирует рост дикого типа (неопубликованные данные; Figaro et al. , 2012). Таким образом, седиментация при 60S предполагает стабильное взаимодействие с фактором, связанным с 60S.Поскольку Trm112 является известным партнером SAM-зависимых метилтрансфераз или белков, содержащих складку метилтрансферазы, мы искали взаимодействие между Trm112 и известными и предполагаемыми метилтрансферазами, участвующими в биогенезе 60S посредством коиммунопреципитации. Мы обнаружили, что Nop2 и Rcm1 являются положительными попаданиями для взаимодействия с Trm112. Интересно, что Nop2 был также идентифицирован при недавней очистке Trm112-TAP (Figaro et al. , 2012). Nop2 — это ядрышковый белок, необходимый для процессинга 27S пре-рРНК в биогенезе 60S (Hong et al., 2001). Было высказано предположение, что это м5С-метилтрансфераза рРНК (Pavlopoulou and Kossida, 2009; Petrossian and Clarke, 2009), но ее активность и сайт модификации не охарактеризованы (Reid et al., 1999; Hong et al. , 2001). Rcm1 (YNL022C), как полагают, также является рРНК m5C-метилтрансферазой, тесно связанной с Nop2 (Pavlopoulou and Kossida, 2009). Однако, как и у Nop2, его субстрат неизвестен. Таким образом, представляет интерес идентифицировать субстраты для этих предполагаемых метилтрансфераз, чтобы определить, требуется ли Trm112 для их активности метилирования, как недавно было продемонстрировано для катализируемого Bud23 метилирования в положении G1575 в 18S рРНК (White et al., 2008 г .; Фигаро и др. , 2012).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы, плазмиды и среды

Все штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании, перечислены в. Штаммы, меченные Trm112-TAP и Utp14-GFP, были получены от Open Biosystems (Lafayette, CO; Ghaemmaghami et al. , 2003; Huh et al. , 2003). AJY3517 ( trm112Δ :: G418r ) был получен путем споруляции и рассечения TRM112 / гетерозиготного диплоидного штамма trm112Δ от Open Biosystems (Winzeler et al., 1999). AJY3524, AJY3549, AJY3547, AJY3538 и AJY3541 были созданы путем скрещивания соответствующих родительских штаммов, спорулированы путем внесения заплат на среду для споруляции в течение 5-7 дней при комнатной температуре и препарированы на среде дрожжевой пептон-декстроза (YPD). Все штаммы были подтверждены ростом на селекционной среде и ПЦР для делеции или метки конкретного гена.

ТАБЛИЦА 1:

Штаммы, использованные в этом исследовании.

Клетки культивировали при 30 ° C, если не указано иное, в богатой среде или синтетической среде отсева, содержащей 2% глюкозы.Все микробиологические методы и клонирование выполняли, как описано ранее (Sambrook et al ., 1989). Для количественной оценки генетического взаимодействия Trm112-Bud23 клетки культивировали в 100 мкл YPD, содержащего 75 мкг / мл ампициллина, в 96-луночных планшетах путем непрерывного встряхивания в течение 36 часов в считывающем устройстве для микропланшетов Powerwave (Biotek, Winooski, VT). Время удвоения рассчитывали по кривым роста, как описано ранее (Toussaint and Conconi, 2006).

Все плазмиды и олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в и, соответственно.Подробная информация о конструкции плазмиды предоставляется по запросу.

ТАБЛИЦА 2:

Плазмиды, использованные в этом исследовании.

ТАБЛИЦА 3:

Олиго, использованные в этом исследовании.

 от слс.детектор импорта клиентов
из sls.protocol import RunStatus


mythen = Детектор ('bl04mythen')

печать (mythen.energy_threshold)

assert mythen.run_status == RunStatus.IDLE

mythen.dynamic_range = 32

с mythen.acquisition (exc_time = 0.1, nb_frames = 10) как acq:
    для event_type данные в mythen.acquisition ():
        если event_type == 'frame':
            печать (данные)
 

 # mythen.toml

[bl04mythen1]
ctrl_port = 1952
stop_port = 1953
 

 $ sls-simulator --log-level = ОТЛАДКА -c mythen.toml
ИНФОРМАЦИЯ 2020-05-15 08: 46: 02,531 root: подготовка к запуску ...
ИНФОРМАЦИЯ 2020-05-15 08: 46: 02,533 SLSServer.Detector (bl04mythen1): готов принимать запросы
 

 из детектора импорта sls.client


mythen = Детектор ('локальный хост')

печать (mythen.energy_threshold)
 

 $ sls-lima --host = bl04mythen -n 10 -e 0.25 -d / tmp / mythen --saving-format = EDF --saving-prefix = миф_
Готово последнее изображение = 10/10
Взял 2.5158393383026123с
 

 из детектора импорта sls.client
из sls.lima.camera import get_ctrl
из Lima.Core импорт AcqRunning

ctrl = get_ctrl ('bl04mythen') # Лима.Core.CtControl
acq = ctrl.acquisition ()
acq.setAcqExpoTime (0,1)
acq.setAcqNbFrames (10)
ctrl.prepareAcq ()
ctrl.startAcq ()
а ctrl.getStatus (). AcquisitionStatus == AcqRunning:
    print ('Выполняется ... Жду завершения!')
    time.sleep (0,1)
print ('Готово!')
 

 $ sls-lima-tango-server <название экземпляра lima tango>
 

Был разработан ряд стратегий для увеличения экспрессии генов Bt . К ним относятся использование лидера малой субъединицы Arabidopsis thaliana и транзитного пептида для повышения эффективности транскрипции и трансляции (27), комбинация промотора 35S и интрона клещевины (4) и амплификация гена токсина в хлоропластах (28). ), а также изменение использования кодонов в соответствии с предпочтениями кодонов у растений (4–6, 10, 29, 30).В настоящем исследовании мы попытались достичь высокого уровня токсина Bt в рисе с помощью химерных генов, состоящих из синтетических и модифицированных кодирующих последовательностей Bt и сильного промотора убиквитина кукурузы, который, как было показано, направляет высокий уровень экспрессии репортерного гена у однодольных растений (31, 32). Хотя уровни токсина в 60% трансгенных растений с R ₀ сильно различались между отдельными растениями с R ₀ , они были иммунологически положительными в отношении CryIA (b) и CryIA (c).В ≈10% этих растений уровень токсинов достигал 3% от общего количества растворимых белков. Это в 10–100 раз превышает содержание CryIA (b) и CryIA (c) в ранее описанных трансгенных растениях риса (4–7). Это значительный прогресс, поскольку такие высокие уровни были предложены в качестве необходимого компонента эффективной комплексной программы борьбы с вредителями, ограничивающей рост устойчивости к насекомым трансгенных культур (33). Интересно отметить, что в предыдущем исследовании (6) с использованием промотора убиквитина кукурузы максимальный достигнутый уровень экспрессии составлял только 0.024% общего растворимого белка. Некоторые из причин дифференциальной производительности этого промотора могут включать методы переноса генов, количество копий гена, генотип хозяина, количество проверенных трансформантов и условия роста растений, которые, безусловно, заслуживают дальнейшего изучения.

Анализы кормления растений R ₁ из трех независимых трансформантов подтвердили, что белки CryIA (b) и CryIA (c), продуцируемые в трансгенных растениях, были высокотоксичными для личинок SSB и YSB. Личинки начинали умирать через 1-2 дня после кормления трансгенными тканями стебля.Смертность ≈100% была достигнута через 4–5 дней после заражения. Уровни токсина в этих трансгенных растениях оценивались в 0,23–0,31% от общего количества растворимых белков во время кормления. Хотя в одном исследовании сообщалось, что значительно более низкое содержание CryIA (b) (0,009% растворимых белков) в трансгенном рисе обеспечивает 100% -ную смертность от YSB и SSB (5), гораздо более высокие уровни CryIA (b) и CryIA (c) ( до 0,05% и 0,024% растворимых белков) привели только к 10–50% и 76–92% смертности от SSB (4) и YSB (6).

В наших биопробах было замечено, что кормление SSB и YSB в первые 1-2 дня тканями трансгенного стебля было очень ограниченным и не вызывало значительного повреждения растений. Фактически, большинство личинок, особенно личинок YSB, были обнаружены мертвыми в ткани оболочки до того, как они смогли проникнуть в стебель. Взятые вместе, эти наблюдения предполагают, что уровни токсина у этих трансгенных животных достаточны, чтобы обеспечить высокую степень устойчивости к SSB и YSB у риса.Дальнейшее исследование взаимосвязи между уровнями токсинов и смертностью насекомых и, следовательно, устойчивостью насекомых, имеет большое значение для разработки подходящей стратегии борьбы с насекомыми для этой основной глобальной продовольственной культуры.

Благодарности

Мы посвящаем эту статью профессору Брайану С. Хартли, F.R.S., за его вдохновение и руководство. Доктор Т. Кандресс, Национальный институт исследований агрономического центра Бордо, 33883 Вилленав д’Орнон, Франция, предоставил плазмиду pKHG4; ДокторP.H. Quail, Центр экспрессии генов растений, Министерство сельского хозяйства США, Беркли, Калифорния, предоставил промотор убиквитина ; Доктор Э. Э. Худ, Pioneer Hi-Bred International, Де-Мойн, Айова, предоставил штамма A. tumefaciens EHA105; SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Уортинг, Великобритания, пожертвовала динатрий тикарциллина; Программы селекции риса, Чжэцзянский сельскохозяйственный университет, Ханчжоу, Китай, и доктор К.А.К. Молденхауэр, Центр исследований риса Университета Арканзаса, Штутгарт, АР, любезно предоставили семена риса.Мы благодарны: доктору Н. Б. Кароцци, Ciba-Geigy, Research Triangle Park, NC, за антитело; Доктора К. Накамура, Университет Нагоя, Нагоя, Япония, и Т. Комари, Джапан Тобакко, Тойода, Япония, за советом; Доктор М. Коэн, Международный научно-исследовательский институт риса, Лос-Баньос, Филиппины, для яиц SSB и YSB и рекомендаций по биологическому анализу насекомых. Техническую помощь экспертов оказали К. Саудер, Д. Боунесс, Л. Фатерс и К. Данг. Работа поддержана Фондом Рокфеллера и Советом по естественным и инженерным исследованиям.Грант Международного фонда науки (C / 1345–2), стипендия Фонда Рокфеллера для получения докторской степени и стипендия Организации Объединенных Наций по вопросам образования, науки и культуры X.C. очень ценятся.

Сноски

• ↵ ‡ Кому запросы на переиздание следует направлять по адресу: Департамент биохимии медицинского факультета Оттавского университета, 40 Marie Curie Private, Оттава, Онтарио, K1N 6N5 Canada.

  No related posts.